姜黄素对骨骼系统的影响

姜黄素(curcumin)是一种提取自干姜科(familyZingiberaceae)姜黄属(Curcumalonga)根茎中的天然多酚化合物，其在诸多亚洲国家中作为草药和日常饮食添加剂使用的历史颇为久远。已知的姜黄素类(curcuminoid)如双阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)主要由姜黄素构成(77%质量百分比，即77wt%)，另两种分别是去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，17wt%)和双去甲氧基姜黄素(bis-demethoxycurcumin，

3wt%)，。姜黄素的化学名为1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮(1，7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1，6-diene-3，5-dione)，化学式为C21H，pKa值为8.54。其化学结构使其极难溶于水，但易溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)和丙酮。大量的研究表明姜黄素具有多种药理学活性，如抗氧化

和抗炎作用，抗癌活性和降血糖作用等。一项Ⅰ期临床试验中即使口服姜黄素剂量达到12g/d依然具有很好的耐受性，未发现与姜黄素有关的临床毒性。

骨重塑是一种动态稳定的平衡系统，若成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的微妙平衡被破坏而加速骨质丢失，就会出现骨强度降低和脆性增加，进而造成骨质疏松症甚至骨折。在细胞水平，姜黄素能够调控多种重要的靶分子，如转录因子［核因子-kappaBeta(nuclearfactor-kappaBeta，NF-κB)、激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)和β-链蛋白(β-catenin)］，酶［环氧化酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)和5-脂肪氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)］，细胞因子［肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白细胞介素-1和-6(interleukin-1和-6，IL-1和-6］，受体［表皮生长因子受体(epithelialgrowthfactorreceptor，EGFＲ)和低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor，LDLＲ)］等。因为上述靶分子多参与骨重塑的调控，研究人员因而认为姜黄素也可以影响骨骼系统。

姜黄素对破骨细胞作用的体外研究

多个研究组的体外实验结果表明姜黄素可以通过不同通路以不同方式抑制破骨细胞分化成熟或者促进其凋亡。破骨细胞是一种起源于单核/巨噬细胞系造血干细胞的多核巨细胞，其分化成熟是一个多通道多层级系统并且依赖肿瘤坏死因子家族(tumornecrosisfactor，TNF)细胞因子-核因子受体激活物-κB配体(receptoractivatorfornuclearfactor-κBligand，ＲANKL)以及巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)。M-CSF对破骨细胞前体的增生和生存起至关重要的作用，而ＲANKL与其受体ＲANK结合被认为是破骨细胞发生(osteoclastogenesis)的起始信号。ＲANKL主要由成骨细胞和间质细胞表达，与ＲANK结合后使TNF受体相关因子(TＲAF)家族蛋白(主要是TＲAF6)形成三聚体而激活，后者进一步激活NF-κB和MAPK(mitogen-activatedkinases)信号。NF-κB信号又可分为经典的NF-κB信号通路和NF-κB旁路途径。在经典的NF-κB信号通路，活化的TＲAF6激活κB抑制物激酶(inhibitorofκBkinase，IKK)，后者使κB抑制物(Iκ)磷酸化而被泛素-蛋白酶体系统降解从而释放出异二聚体化的NF-κB(主要为p50-ＲelA)而发挥作用。除NF-κB信号以外，ＲANK/TＲAF6/AP-1信号在破骨细胞的分化中也起到十分重要的作用。转录因子AP-1是由Fos(c-Fos、FosB、Fra-、Fra-2)，Jun(c-Jun、

JunB、JunD)和ATF(ATFa、ATF2、ATF3、ATF4、B-ATF)蛋白亚基构成的二聚体复合物，

其中c-Fos和c-Jun是其重要的功能组分。Ozaki等用10μmol/L姜黄素处理分离纯化的兔破骨细胞后发现凋亡率显著增加，并且这种促凋亡效果具有时间和剂量依赖性。凝胶迁移率实验分析结果说明促凋亡作用主要通过抑制NF-κB信号而不是AP-1信号。Metzler等的研究用1和10μmol/L姜黄素处理人外周血分离的前破骨细胞后TＲAP(+)细胞数量与对照组相比分别降低了56%和81%，骨吸收活性则分别降低了56%和99%，呈现出明显的剂量相关性。

此外，1和10μmol/L姜黄素处理也显著抑制ＲANKL诱导的NF-κB激活(分别下降约43%和79%)。通过Westernblot法检测IκB磷酸化水平发现姜黄素对IKK活性有明显的抑制作用。Bharti等还发现在ＲANKL刺激ＲAW.7细胞诱导分化24h后再加用姜黄素(10μmol/L)处理，对破骨细胞形成的抑制效果最明显。而ＲANKL刺激48h后再加入姜黄素，其抑制效果反而随着时间的增加而逐渐降低。因此作者认为姜黄素作用于ＲANKL诱导破骨细胞形成通路的早期阶段，这一结论与NF-κB激活是破骨细胞前体对ＲANKL刺激的极早期反馈相一致。此外，ＲANKL能够激活野生型ＲAW.7细胞中的NF-κB，但是不能激活稳转IκBα显性失活细胞中的NF-κB，也不能诱导其分化，这更进一步说明了NF-κB在ＲANKL诱导破骨细胞形成中的决定性作用。

ＲANKL对于破骨细胞分化的起始作用更加突显了成骨细胞和间质细胞在该过程中的重要性。事实上，多种促破骨细胞分化因子都以成骨细胞和间质细胞为靶细胞，促进其分泌ＲANKL。研究发现炎性细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-1可刺激成骨细胞和间质细胞表达ＲANKL而促进破骨细胞前体分化。IL-1也可以提高环氧化酶2(cyclo-oxygenase，COX)-2的活性，进一步促进前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)合成，PGE2又可以促进ＲANKL表达。Oh等用不同浓度(＜4μmol/L)的姜黄素与IL-1α(10ng/mL)共培养C57BL/6J小鼠骨髓间质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC)，结果显示姜黄素以剂量依赖的方式下调IL-1α诱导的ＲANKL表达水平，显著抑制IL-1α对破骨细胞形成的刺激作用，但对IL-1α抑制OPG表达无明显作用。此外，姜黄素对IL-1α促进COX-2mＲNA表达无明显影响，向共培养体系中加入NS(一种选择性COX-2抑制剂)能显著降低TＲAP(+)细胞数量，但并未逆转姜黄素的抑制效果，提示姜黄素抑制破骨细胞形成与COX-2无关。同样的，甲状旁腺素(parathyroidhormone，PTH)也刺激成骨细胞和间质细胞表达ＲANKL。这可以解释在破骨细胞本身缺乏PTH受体的情况下，若PTH分泌过多，破骨细胞分化仍然明显加速的现象。Yamaguchi等发现姜黄素(0.1～.0μmol/L)对大鼠股骨骨干和干骺端体外培养系统中钙含量无明显影响，说明姜黄素不能在该条件下促进骨形成。有趣的是，姜黄素(0.01～10.00μmol/L)能够显著抑制PTH(0.1μmol/L)对破骨细胞形成的刺激作用，但却不能抑制股骨组织培养中PTH诱导的骨钙含量降低。

活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ＲOS)在细胞生存和分化成熟过程中扮演着第二信使和信号转导调控的重要角色。氧化应激(oxidativestress)状态下，ＲOS水平升高会刺激破骨细胞分化，促进骨吸收活性。同时，ＲOS也调控包括NF-κB信号在内的多种与破骨细胞分化有关的信号通路。由于NF-κB抑制剂可以显著降低ＲANKL诱导的NFATc1水平，而在破骨细胞分化末期，NFATc1又与Fos和Jun蛋白共同诱导破骨细胞特异性基因表达。因此，NFATc1被认为是破骨细胞分化过程中转录因子NF-κB和AP-1共同的靶基因。Moon等和Kim等的研究证实姜黄素(＜5μmol/L)可以显著抑制小鼠骨髓细胞内高半胱氨酸(homocysteine)活性，上调抗氧化酶-谷胱甘肽过氧化酶-1(glutathioneperoxidase-1)的表达水平和活性，降低细胞内ＲOS生成水平，从而抑制破骨细胞分化。同时，上述作用与姜黄素抑制破骨细胞内ＲANKL诱导的IκB磷酸化，抑制c-Fos和NFATc1表达有关。雌激素缺乏可损害胞内抗氧化系统，诱导加重细胞内氧化应激，同时促进ＲANKL分泌。反过来，ＲANKL分泌增加又可以刺激骨髓细胞产生更多的ＲOS，而ＲOS正是破骨细胞分化的信号之一。

姜黄素发挥其抗氧化作用，降低细胞内ＲOS水平，可能是其抑制破骨细胞分化的可能机制之一。姜黄素对成骨细胞作用的体外研究成骨细胞起源于未分化的多能间质细胞，其增生和分化成熟与骨形成作用密切相关。目前，姜黄素对成骨细胞作用的研究依然较少。

P21WAF1/CIP1是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物(cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)，属于Cip/Kip家族，在成骨细胞分化过程中起“制动”作用。姜黄素(10μmol/L)能够促进体外分离培养的大鼠颅骨来源成骨细胞(ＲOB)中P21WAF1/CIP1mＲNA表达，抑制组蛋白H1磷酸化而抑制染色质凝缩，诱导G1期细胞周期停滞从而抑制成骨细胞增生。此外，姜黄素(＜10μmol/L)还以剂量和时间依赖形式抑制钙离子沉积和矿化小结的形成，但是对碱性磷酸酶活性和骨钙素的mＲNA表达水平无明显影响。

实验证明细胞内ATP水平可以调控细胞死亡方式:高代谢高ATP水平促进胞内ＲOS产生，进一步激活caspase-3而诱导细胞凋亡;低ATP水平主要诱导细胞坏死。Chan等用不同浓度姜黄素(12.5～.0μmol/L)与人成骨细胞系HFOb1.19共培养后发现成骨细胞生存被显著抑制，其中12.5～25.0μmol/L姜黄素提高了胞内ATP水平和ＲOS浓度，促进caspase-3激活和PAＲP剪切，主要诱导成骨细胞凋亡;50～μmol/L姜黄素则降低胞内ATP水平，对胞内ＲOS浓度和caspase-3活化无明显影响，主要诱导细胞坏死。而且，成骨细胞从凋亡向坏死的快速转变只出现在一个相对狭窄的姜黄素浓度范围内(25～50μmol/L)，即浓度太高时对成骨细胞呈现抑制作用。

尽管姜黄素在之前的体外研究中展现出对破骨细胞一致的抑制作用，因而被视为一种可能用于“治疗”骨质疏松症的药物成分，但是其作用于成骨细胞的体外研究结果却并不积极正面，这可能与实验过程中姜黄素的浓度和处理对象不同有关。在Notoya等的实验中，姜黄素的浓度与前人体外破骨细胞实验中浓度近似(≤10μmol/L)，却发现姜黄素可以抑制大鼠原代成骨细胞增生和功能。而Chan等将姜黄素浓度提高至12.5～.0μmol/L后，其仍然展现出对人成骨细胞系HFOb1.19的负性抑制作用。尽管如此，与体内研究相比，体外试验仍然是一种处理环境相对可控，潜在干扰因素较少的试验方式。因此，姜黄素对于骨重塑过程的影响以及作用方向仍然需要体内研究进一步明确。

姜黄素对骨骼系统作用的体内研究由于在之前的体外研究中展现出了对破骨细胞分化和骨吸收功能的抑制性，姜黄素被认为是可能缓解骨质疏松性骨丢失、提高骨强度的潜在药物成分。以双侧卵巢摘除(ovariectomize，OVX)大鼠构建绝经后骨质疏松模型可模拟雌激素缺乏时由于破骨细胞功能亢进和骨更新加快而导致的小梁骨过度丢失，这也是目前姜黄素体内骨保护作用的主要研究。

French等经饲料给予OVX大鼠补充姜黄素(1.5～15.0mg/d)。结果显示与对照组相比，姜黄素可以改善OVX大鼠腰椎BMD但不能改善股骨BMD值。此外，姜黄素还可以降低血骨钙素和胶原片段浓度，提示其对OVX大鼠体内破骨细胞介导的骨吸收有抑制效果，但差异无统计学意义。有趣的是，补充姜黄素15mg/d可以显著提高OVX大鼠股骨尺寸，这也导致股骨致骨折能量(energytofracture)和姜黄素剂量(1.5、5、15mg/d)之间存在明显的剂量反应关系，这一现象可能与雌激素缺乏早期主要以小梁骨快速丢失，而皮质骨改变不明显和长骨纵向生长增加有关。Folwarczna等［在摘除大鼠双侧卵巢前后给予其口服姜黄素(10mg/kg·d)4周后发现，当大鼠体内雌激素水平正常时，姜黄素可以显著降低血雌二醇水平，轻度提高松质骨形成，但会抑制骨矿化作用。当雌激素缺乏时，姜黄素能够明显降低血清总胆固醇水平，轻微改善骨组织形态学指标，但是对骨矿化作用和股骨颈机械强度无明显积极影响。因此，研究人员认为以10mg/kg·d的剂量口服姜黄素并不能改善大鼠因雌激素缺乏而出现的骨质疏松。与之前的体内研究未能得出姜黄素对骨骼系统有积极作用的结论不同，Hussan等的研究结论似乎更为积极和明确。实验中Hussan等将姜黄素口服剂量提高至mg/kg共60d，结果证明姜黄素可以显著改善因雌激素缺乏而受损的各项骨组织形态学指标，如骨量、骨小梁厚度和骨小梁数量等。同时，姜黄素亦能明显提高OVX大鼠体内成骨细胞数量，抑制破骨细胞数量并降低骨表面侵蚀面积(erodedsurface)。

除了OVX大鼠骨质疏松模型以外，姜黄素在APP/PS1转基因小鼠阿尔茨海默氏症模型和链脲霉素诱导大鼠糖尿病模型(streptozotocin-induceddiabetes)中均展现出明确的骨保护效果。Hie等用链脲霉素(streptozotocin)诱导大鼠糖尿病模型并每日经饲料补充姜黄素(mg/d)，8d后获得骨髓细胞并体外培养，其中糖尿病组大鼠骨髓细胞形成TＲAP(+)细胞的能力更强。而补充姜黄素可降低TＲAP(+)细胞数量至接近对照组水平。此外，姜黄素可显著降低因糖尿病所致的破骨细胞前体数量增加，同时也可下调糖尿病组大鼠细胞内升高的c-Fos和c-Jun的mＲNA和蛋白表达水平。以上结果说明姜黄素可以通过抑制AP-1信号抑制糖尿病大鼠体内破骨细胞形成。在APP/PS1转基因小鼠，姜黄素(mg/kg)可以使升高的TNF-α和IL-6水平回落至野生型对照小鼠水平。这说明上述炎性细胞因子可能参与姜黄素对骨组织的保护作用，但具体机制尚不清楚。

值得注意的是，姜黄素在上述不同的体内研究中均是通过每日经饲料口服给药，但是在给药量较小时(French等应用1.5～15.0mg/d以及Folwarczna等应用10mg/kg·d)并未在体内展现出显著的骨保护作用，甚至出现轻微的抑制骨矿化作用，但差异无统计学意义。联系之前的体外试验结果:姜黄素在低浓度时不仅能够抑制破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能，也能同时抑制成骨细胞增生和功能，但目前尚不清楚这是否能够在一定程度上解释为何姜黄素在低给药量时未能正向调控骨重塑过程。然而，提高给药量和延长给药时间却可以在动物模型体内产生明确的骨保护作用。

展望

近20年来，姜黄素因其展现出多种药理活性而备受

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