非小细胞肺癌活检标本ALK表达及临床病理

来源：中华病理学杂志

作者：唐荣，郭蕾，刘秀云，李文斌，应建明

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人类间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因是肺腺癌具有治疗预测作用的分子标志物[1，2]。我们总结了例非小细胞肺癌患者活检组织标本中ALK蛋白表达及基因融合状态，并探讨其与临床病理特征的关系。

一、资料与方法

　　1.临床资料：

　　收集年3月至年7月中医院病理科存档的通过支气管镜、CT和B超引导下穿刺及门诊手术切取的非小细胞肺癌标本例，均为晚期不可手术患者。所有入选标本均经4%中性缓冲甲醛液固定石蜡包埋，且常规病理组织学检查确诊。

　　2.荧光原位杂交（FISH）检测ALK基因融合：

　　采用ALK双色分离探针（Abbott公司），探针所对应的3′端标记为橘红色，5′端标记为绿色，其中橘红色信号覆盖酪氨酸激酶活性区。结果判读在荧光显微镜下选取50个肿瘤细胞，要求肿瘤细胞核轮廓及信号清晰，每个细胞核内至少有一组红、绿信号，如果红绿信号分离（距离≥2个信号直径）或额外出现单独的红色信号，视为阳性细胞，50个观察细胞中阳性细胞5个为阴性标本，25个为阳性标本，如果在5～25个之间则再计数50个细胞，个细胞内合计阳性细胞数≥15个为ALK阳性。

　　3.免疫组织化学（IHC）检测ALK蛋白表达：

　　采用BenchMark全自动免疫组织化学染色机和D5F3抗体试剂盒（Roche诊断公司），按照抗体试剂盒说明书进行检测。结果判读标准：采用二元判读法，即ALK阳性：肿瘤细胞中存在强的颗粒状胞质染色（任何百分比的阳性肿瘤细胞）。ALK阴性：肿瘤细胞内不存在强颗粒状胞质染色。

　　4.统计学方法：

　　数据资料采用SPSS17.0统计学软件进行统计和分析。计数资料的比较采用χ2检验。所有P值均基于双向假设检验，P0.05为差异有统计学意义。

　二、结果

　　1.FISH和IHC检测结果：

　　例患者中，CT和B超引导下穿刺标本例（52.8%），支气管镜标本例（45.1%），门诊手术切取标本8例（2.1%）。其中，原发灶来源例（87.6%），转移灶48例（12.4%）。例患者中腺癌例（78.3%），鳞癌22例（5.7%），非特指型非小细胞肺癌62例（16.0%）；患者年龄≤55岁例（39.7%），55岁有例（60.3%）；吸烟患者例（36.9%），不吸烟患者例（63.1%）。IHC阳性45例（11.6%），FISH阳性41例（10.6%），有4例IHC阳性患者FISH为阴性。以FISH结果作为标准，敏感性.0%，特异性98.8%，总体符合率99.0%。

　　2.IHC检测ALK蛋白表达、FISH检测ALK基因融合状态与临床病理特征的关系（图1，图2，图3，图4，表1）：

图1，2肺鳞癌；图1免疫组织化学检测间变性淋巴瘤激酶（ALK）胞质阳性BenchMark全自动免疫组织化学中倍放大图2荧光原位杂交（FISH）检测ALK阳性（↑）FISH×0

　　图3，4肺腺癌；图3免疫组织化学检测ALK胞质阳性BenchMark全自动免疫组织化学中倍放大图4FISH检测ALK阳性（↑）FISH×0

IHC阳性肺癌患者中位年龄50岁，阴性患者中位年龄59岁。IHC检测ALK蛋白表达在年龄分布上差异有统计学意义（P0.05）：≤55岁患者阳性率21.4%（33/）明显高于55岁患者阳性率5.1%（12/）。ALK蛋白表达与患者性别、组织类型、吸烟史、标本来源均无关。

　　3.ALKIHC＋/FISH－患者抗ALK治疗疗效：

　　4例ALKIHC＋/FISH－患者中有2例接受了抗ALK治疗（克唑替尼），资料显示2例患者疗效均为部分缓解，无疾病进展时间分别为13个月和10个月。

三、讨论

　　EML4-ALK融合基因的准确检测对于指导临床用药起着至关重要的作用。FISH是研究检测ALK融合基因最早也是最公认的方法。近些年D5F3、5A4等克隆的抗体在肺癌ALK蛋白表达的检测中具有高度的敏感性和特异性，得益于经济、易操作在我国病理科开始得到推广。国外研究显示，在非小细胞肺癌患者中，EML4-ALK融合基因阳性率约为5%。中国患者ALK的阳性率为3%～11%[3]，结果差异较大，分析原因可能与各实验室使用的抗体、探针、实验条件及操作人、样本量等相关，各地患者检测时的年龄组也不尽相同。本研究对肺支气管镜标本、穿刺和门诊手术切取活检标本共例进行了IHC检测，并与FISH检测进行了比对。结果IHC阳性45例，阳性率为11.6%（45/），比文献报道高[4]，主要与以下原因相关：（1）部分病例是在EGFR、KRAS检测阴性后进行ALK检测的，存在非随机性；（2）本组病例均为晚期肺癌患者，而ALK易位与临床分期相关，晚期人群ALK阳性率高。另外，我们的结果发现，ALK易位与患者年龄小相关，本组研究患者≤55岁的有例，阳性率达21.4%，明显高于55岁患者阳性率（5.1%，12/）。

　　研究表明IHC与FISH结果的符合率可达98.8%，判读结果的可重复性为99.7%[5]。多项VentanaIHC与FISH对照研究表明二者的符合率为94%～%[6]。本研究FISH与IHC的符合率达到99.0%，与上述文献报道一致。同时，研究表明VentanaIHC和FISH在检测ALK时少数病例存在差异。Paik等[7]采用ALK-5A4抗体和Ventana系统检测了例患者，其中有10例IHC＋/FISH－。而本研究中，也有4例IHC＋/FISH－。本研究未发现IHC阴性但FISH阳性患者。虽然FISH方法已作为ALK阳性非小细胞肺癌诊断的标准参照方法，但也存在诸多不足。另外15%这个Cut-off值的设定一直存在争议，其次FISH方法本身也存在假阴性。此外，由于ALK断裂后可能与其他基因相融合而并非与EML4融合而产生蛋白高表达，但FISH探针检测不到也可能导致FISH假阴性；小活检标本、组织出血、老细胞过多、坏死等造成内源性过氧化物酶释放导致IHC假阳性，相比于常规手术标本，ALK免疫组织化学易出现判读较难的病例，表现为局灶较强的肿瘤细胞着色，这些标本尽管IHC判为阴性，但应建议FISH检测，本研究中这些标本FISH结果均为阴性。而本研究中出现的4例IHC＋/FISH－样本，需采用其他检测方法进一步研究。

　　参考文献：

　　[1]KwakEL,BangYJ,CamidgeDR，etal.Anaplasticlymphomakinaseinhibitioninnon-small-celllungcancer[J].NEnglJMed,,（18）：-.DOI:10./NEJMoa6448.

　　[2]YingJ,GuoL,QiuT,etal.DiagnosticvalueofanovelfullyautomatedimmunochemistryassayfordetectionofALKrearrangementinprimarylungadenocarcinoma[J].AnnOncol,,24（10）：-.DOI:10./annonc/mdt.

　　[3]中国医师协会肿瘤医师分会，中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会。中国表皮生长因子受体基因敏感突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南（版）[J].中华肿瘤杂志，,36（7）:-.DOI:10./cma.j.issn.-..07..

　　[4]MartinezP,Hernández-LosaJ,MonteroM,etal.FluorescenceinsituhybridizationandimmunohistochemistryasdiagnosticmethodsforALKpositivenon-smallcelllungcancerpatients[J].PLoSOne,，8（1）：e.DOI:10./journal.pone.00.

　　[5]孟辉，高献争，张岚，等。增强免疫组化和原位杂交方法检测非小细胞肺癌的ALK重排的临床可行性[J].中国肺癌杂志，，18（2）：75-79.DOI:10./j.issn.9-..02.04.

　　[6]MincaEC,PortierBP,WangZ,etal.ALKstatustestinginnon-smallcelllungcarcinoma:correlationbetweenultrasensitiveIHCandFISH[J].JMolDiagn,,15（3）：-.DOI：10./j.jmoldx..01..

　　[7]PaikJH,ChoeG,KimH,etal.Screeningofanaplasticlymphomakinaserearrangementbyimmunohistochemistryinnon-smallcelllungcancer:correlationwithfluorescenceinsituhybridization[J].JThoracOncol,,6（3）：-.DOI:10./JTO.0beb82e8.

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